Синтез белков для безопасной медицины

Анастасия ГУСАЧ, сотрудник лаборатории структурной биологии рецепторов, сопряжённых с G-белком, МФТИ: Сейчас мы находимся в лаборатории структурных исследований рецепторов, сопряжённых с G-белком, в МФТИ. Наша лаборатория является достаточно молодой. Она появилась всего 5 лет назад, но за это короткое время мы успели довести почти до конца уже много важных и значимых на мировом уровне проектов. Сейчас я расскажу немного о том проекте, которым занимаюсь лично. Этот проект связан со структурными исследованиями рецепторов, связанных с воспалением. Для чего это нужно? Структуры высокого разрешения GPCR позволяют создавать высокоспецифичные лекарства, которые будут иметь минимум побочных эффектов. Побочные эффекты у лекарств возникают из-за того, что эти лекарства недостаточно специфичны. Т. е. они могут взаимодействовать как с целевым белком, так и с различными другими белками. Если мы, например, хотим создать лекарство для блокировки, блокады боли, а наше лекарство будет ещё взаимодействовать с рецепторами, отвечающими за воспаление, то мы можем получить не только блокаду боли, но и воспаление, что является побочным эффектом. Мы этого не хотим. Поэтому мы желаем знать структуру нашего целевого рецептора с максимальным (т.е. атомным) разрешением. И после этого мы посмотрим на него, посмотрим на все остальные рецепторы и решим, чем же он такой особенный, и как нам сделать лекарство, которое будет ориентировано только на него. Это задача медицины нового поколения. Сейчас она является очень актуальной. Метод, который позволяет получать структуры белков с максимальным разрешением, на данный момент — это рентгеноструктурный анализ кристаллов белка. Однако белки, на самом деле, не хотят вставать в кристаллы. Они в наших клетках существуют просто в виде единичных молекул либо в виде комплексов. Мы изучаем мембранные белки, к примеру; они встроены в мембрану. Нам нужно каким-то образом заставить их вставать в кристалл. Для того, чтобы просветить их рентгеном и получить усиленную картинку дифракции, потому что картину дифракции от одной молекулы мы не отличим — у неё будет слишком маленькая интенсивность. А если таких молекул будет стоять очень много и в одинаковой ориентации, то интенсивность рассеяния данной молекулы будет увеличена во много-много раз. И мы сможем увидеть картинку дифракции, по которой мы восстановим первоначальную структуру молекулы. Так вот: вся эта история начинается с производства белка, который пригоден для кристалла. Всем известно, что в нашем организме ДНК кодирует все белки, из которых мы состоим. Поэтому для того, чтобы изменить белки, нам нужно изменить последовательность ДНК. Мы хотим изменить наши белки таким образом, чтобы повысить вероятность кристаллизации. Поэтому на уровне ДНК мы должны сделать какие-то изменения. Мы вносим какие-то мутации: мы можем укоротить белок либо удлинить его. При этом всегда в последующем шаге мы контролируем то, что данный белок до сих пор функционален. Так вот: мы хотим сделать белок; мы берём последовательность ДНК и отдаём её в клетки так, чтобы эти клетки затем произвели в большом количестве наш белок. Для этого в нашей лаборатории используются клетки насекомых. Также возможно использовать клетки человека (различные клеточные линии), клетки дрожжей, клетки бактерий. Но в случае наших белков GPCR нам нужны клетки эукариот, чтобы правильным образом фолдировать белки (которые при этом наиболее просты в работе). Поэтому мы используем яйцеклетки насекомых, которые мы выращиваем в специальной комнате, где поддерживаются максимально «чистые», стерильные условия. Мы используем специальные шейкеры и производим наш белок в этих клетках. После того, как мы сделали белок в клетках, мы должны его каким-то образом извлечь. Наш белок мембранный, поэтому нам его надо каким-либо образом добыть из клеточной мембраны. Для этого мы можем использовать такие молекулы, которые называются детергенты. По сути, это то же самое мыло, которое мы используем в быту для того, чтобы растворить жир, который у нас находится на посуде или ещё где-то. Ведь клеточная мембрана состоит из липидов, что, по сути, тот же самый жир. Мы должны его удалить, и тогда мы получим наши целевые белки GPCR, силлабилизированные (как это называется по-научному), т. е. в растворённой в молекулах детергента форме. После этого мы их концентрируем в очищенном виде и кристаллизуем. Для этого есть целый инструментарий методов — чтобы работать с мембранными белками. Мы используем т.н. «липидную кубическую фазу», которая мимикрирует под нативную мембрану клетки. Таким образом, это может заменять нашему белку его природное окружение. Он себя чувствует комфортно, если можно так выразиться, и собирается в кристаллы. Эти кристаллы мы выращиваем в 96-луночных маленьких плашках. С помощью различных роботов мы подбираем условия кристаллизации. Затем с помощью специальных имиджеров мы ранжируем кристаллы по качеству — визуально и с помощью методов флуоресценции. Затем мы их везём на источник синхротронного излучения. Мы сотрудничаем со многими лабораториями мира — это Франция, Германия, США, Корея и др. Там мы тестируем наши кристаллы на очень мощных источниках рентгена (X-Ray) и получаем картины дифракции. Затем ребята, которые специализируются в обработке данных, обрабатывают данные картины дифракции и с помощью разных методов получают те самые искомые структуры высокого разрешения в комплексе с какими-то лигандами. Лигандами для G-белок-сопряжённых рецепторов являются различные малые молекулы. Также ими могут быть белковые молекулы или какие-то гормоны. Смысл в том, что клетке нужно как-то узнавать о том, что к ней пришла сигнальная молекула. Она должна как-то на это реагировать. Такими передатчиками этого сигнала как раз являются G-белок-сопряжённые рецепторы. Когда вы, например, испугались, и у вас выделился адреналин, это вещество взаимодействует с адренергическим рецептором, говоря клетке о том, что нечто произошло и нужно срочно реагировать. Посредством изменения конформации нашего рецептора передаётся сигнал внутрь клетки, происходит какое-то событие — например, выброс кальция или ещё какое-то клеточное событие, которое уже дальше вызывает огромный каскад реакций, который происходит внутри клетки и приводит к клеточному ответу. Вот тем самым «бутылочным горлышком», которое передаёт сигнал от маленькой молекулы к целой большой клетке, является как раз наш рецептор. На данный момент наши исследования уже находятся на стадии структур и функциональных тестов. Я ещё скажу пару фраз о том, зачем нам нужны функциональные тесты. Когда мы кристаллизовали наши рецепторы, мы их как-то изменяли для того, чтобы они закристаллизовались. Но ведь нам нужны структуры тех самых первых рецепторов, которые есть у нас в организме, а не тех рецепторов, которые мы поменяли для того, чтобы было легче с ними работать? Нам нужно убедиться, что наши закристаллизованные рецепторы аналогичны по функциональным свойствам рецепторам дикого типа. Поэтому мы делаем различные тесты, где мы сравниваем первоначальный рецептор и закристаллизованный рецептор. Мы видим, что, на самом деле, несмотря на то, что мы внесли модификации, они реагируют на лиганды одинаково. Они одинаково себя ведут в клетке. И поэтому мы можем с хорошей степенью уверенности сказать, что это та самая структура, которая нужна для разработки лекарств. И сейчас мы уже думаем про то, как наши структуры помогут в создании новых лекарств для наших целевых рецепторов. Мы надеемся, что это поможет в будущем разработке лекарств.